Principio El grupo tiol en N-acetato de metilo-4-mercapto-1,8-naftalimida tiene un efecto PET en el núcleo fluorescente de la naftalimida, y su propia fluorescencia es muy débil; en presencia de acroleína, El grupo mercapto de N -Acetato de metilo-4-mercapto-1,8-naftalimida y acroleína forman un aducto mediante la reacción de adición de Michael, que suprime el efecto PET. El aducto se produce bajo la excitación de la luz emitida a una longitud de onda de 380 nm. Fuerte fluorescencia, con un pico a una longitud de onda de 510 nm. Su intensidad de fluorescencia es proporcional a la concentración de acroleína en la muestra a analizar en condiciones fijas. Se detecta mediante un lector de microplacas con detector de fluorescencia y se cuantifica mediante un método estándar externo. El principio de determinación de acroleína mediante el método de sonda fluorescente se muestra en la Figura 1. Figura 1 Principio de determinación de acroleína mediante el método de sonda fluorescente 5 Reactivos y materiales 5.1 Reactivos A menos que se indique lo contrario, todos los reactivos son de grado analítico y el agua es agua de primer grado especificada en GB/T6682. Anhídrido 4-bromo-1,8-naftalenodicarboxílico (grado analítico). Glicina (analíticamente pura). Trietilamina (grado analítico). Etanol (grado analítico). Ácido clorhídrico (grado analítico). Ácido p-toluenosulfónico (grado analítico). Metanol (grado analítico). Nonahidrato de sulfuro de sodio (analíticamente puro). Dimetilsulfóxido (DMSO, grado analítico). Ácido cítrico (grado analítico). Hidrógenofosfato disódico (analíticamente puro). Acroleína (grado analítico). 5.2 Preparación de sondas fluorescentes: Se hicieron reaccionar 554 mg de anhídrido 4-bromo-1,8-naftalenodicarboxílico, 165 mg de glicina y 252 mg de trietilamina con agitación magnética a reflujo en etanol a 80°C durante 6 horas. Completado, se enfrió a temperatura ambiente y se añadió a la solución de reacción. Se ajusta el pH con 2,5 mL de solución de ácido clorhídrico 1 M hasta que precipita un precipitado blanco. El sólido obtenido por filtración por succión se lava con 10 mL de agua y etanol respectivamente. El sólido blanco obtenido es N-acetoxi-4-bromo-1,8-naftalimida; a temperatura ambiente, se disolvieron 167 mg de N-acetoxi-4-bromo-1,8-naftalimida y 600 mg de nonahidrato de sulfuro de sodio en 5 ml de N. N-dimetilformamida y se agitó durante 24 horas. Una vez completada la reacción, se vertió la solución de reacción en 20 ml de agua y se ajustó el pH a 2 con una solución acuosa de ácido clorhídrico 1 M, y precipitará un precipitado amarillo. Después de lavar el sólido obtenido mediante filtración por succión cinco veces con agua, el sólido amarillo obtenido es N-acetoxi-4-mercapto-1,8-naftalimida (Pr-ACR), se liofiliza y se coloca en un refrigerador a -20°C. Reservado. 5.3 Preparación del reactivo: El pH del tampón de ácido cítrico-hidrogenofosfato disódico es 2,2, 1 mmol/L. Disolver 15,198 g de ácido cítrico monohidrato y 1,955 g de hidrogenofosfato disódico dodecahidratado en agua y luego utilizar un matraz aforado de 250 ml para ajustar el volumen. Solución madre de sonda: se disuelven 2,15 mgPr-ACR en 0,5 ml de DMSO para obtener una solución madre de sonda con una concentración de 150 mmol/L. La solución madre debe prepararse y usarse inmediatamente. Solución de trabajo de la sonda: Pipetear 50 μLPr-ACR de solución madre en un matraz volumétrico de 5 ml y ajustar el volumen a 5 ml con la solución tampón del punto 4.3.1. La solución de trabajo debe prepararse y usarse inmediatamente. 5.4 Patrón estándar de acroleína (C3H4O, número CAS: 107-02-8): pureza superior al 98,0%. 5.5 Preparación de solución estándar: Prepare una solución con concentración de acroleína de 30 μmol/L con agua, luego diluya y mezcle con agua para obtener una serie de soluciones estándar con concentraciones (0 μmol/L, 3 μmol/L, 6 μmol/L , 12 µmol/L, 18 µmol/L, 24 µmol/L, 30 µmol/L). 6 Instrumentos y Equipos 6.1 Lector de microplacas (con detector de fluorescencia, Ex250-600nm, Em280-600nm). 6.2 Placa de 96 pocillos (negra). 6.3 Trituradora (finura de malla 30-100). 6.4 Balanza: Sensibilidad: 0,00001g. Pipeta 6,5 (1μL-10μL, 10μL-100μL y 100μL-1000μL). 6.6 Cristalería general. 6.7 Centrífuga (12000 rpm, 14000 xg). 7 Pasos de la prueba 7.1 Trazado de una cuasicurva Pipetee 100 μL de la solución de trabajo de la sonda en 4.3.3 en una placa de 96 pocillos y luego agregue 50 μL de solución estándar de acroleína de diferentes concentraciones en 4.5 para que la concentración de acroleína sea 0 μmol/ L y 1 μmol respectivamente. /L, 2 μmol/L, 4 μmol/L, 6 μmol/L, 8 μmol/L, 10 μmol/L, agitar bien y reaccionar a 25°C durante 90 minutos, luego colocarlo en un lector de microplacas para la detección de fluorescencia y lea la longitud de onda a 510 nm. El valor de intensidad de fluorescencia a (la longitud de onda de excitación es 380 nm) y su espectro de emisión de fluorescencia se muestran en el Apéndice A. 7.2 Preparación de la muestra: agregue 1 g de polvo alimenticio molido en un tubo de centrífuga de 15 ml, agregue 5 ml de agua, revuelva uniformemente y realice una extracción ultrasónica durante 20 minutos, luego centrifugue a 10000 r/min durante 20 minutos para recolectar el sobrenadante. El material precipitado en el tubo de centrífuga se extrajo dos veces con 2 mL de agua según la operación anterior, se combinaron los sobrenadantes obtenidos de las tres extracciones y se ajustó el volumen a 10 mL para su posterior uso. 7.3 Determinación de muestras: Pipetee 100 μL de la solución de trabajo de la sonda en 4.3.3 en una placa negra de 96 pocillos, luego agregue 50 μL de la solución de extracción de muestras en 6.2, agite bien y colóquela a 25 °C para que reaccione. 90 minutos antes de usar un lector de microplacas. Para la detección de fluorescencia, lea el valor de intensidad de fluorescencia a una longitud de onda de 510 nm (la longitud de onda de excitación es 380 nm) y repita cada tratamiento tres veces. 7.4 El experimento en blanco se llevará a cabo de acuerdo con las condiciones y procedimientos de medición anteriores, excepto que la muestra no se pese. 8 Procesamiento de datos de prueba El contenido de acroleína en la muestra se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula: ………………………………………(1) Donde: X——El contenido de acroleína en la muestra, mg /kg (mg /kg); 56,06 - masa molar de acroleína; C - concentración de masa molar de acroleína en la solución de muestra, micromol/L (μmol/L); V - volumen total de la muestra que se analiza, mililitros (mL); m——La masa de la muestra, gramos (g). Los resultados del cálculo se expresan como la media aritmética de tres resultados de medición independientes obtenidos en condiciones de repetibilidad, y los resultados conservan tres cifras significativas. 9 Precisión 9.1 Disposiciones generales La precisión de este documento se determina de acuerdo con las disposiciones de GB/T6379.2, y los valores de repetibilidad y reproducibilidad se calculan con un nivel de confianza del 95%. 9.2 Repetibilidad En condiciones de repetibilidad, la diferencia absoluta entre dos resultados de medición independientes obtenidos no deberá exceder el 10% de la media aritmética. 9.3 Reproducibilidad En condiciones de reproducibilidad, la diferencia absoluta entre dos resultados de medición independientes obtenidos no deberá exceder el 10% de la media aritmética. 10 Informe de prueba El informe de prueba debe proporcionar al menos los siguientes aspectos:
——Objeto de prueba;
——Estándares utilizados;
——Métodos utilizados;
——Resultados;
——Fenómenos anormales observados;
——Fecha de prueba. Apéndice A (informativo) Cuadro del espectro de emisión de fluorescencia
T/GDBK 007-2023 Historia
2023T/GDBK 007-2023 Rapid determination of acrolein in baked food——Microplate reader method (fluorescent probe method)