T/SDAA 0045-2021
Detección de Pasteurella multocida mediante PCR (Versión en inglés)

Estándar No.

T/SDAA 0045-2021

Idiomas

Chino, Disponible en inglés

Fecha de publicación

2021

Organización

Group Standards of the People's Republic of China

Ultima versión

T/SDAA 0045-2021

Alcance

Método PCR para la detección de Pasteurella multocida 1 Alcance Este documento especifica el método de detección por PCR de Pasteurella multocida en cerdos. Este método es adecuado para la detección de Pasteurella multocida en cerdos. 2 Documentos normativos de referencia El contenido de los siguientes documentos constituye disposiciones esenciales de este documento a través de referencias normativas en el texto. Entre ellos, para documentos de referencia con fecha, solo se aplica a este documento la versión correspondiente a la fecha; para documentos de referencia sin fecha, se aplica a este documento la última versión (incluidas todas las modificaciones). NY/T541 Especificación técnica para la recolección, almacenamiento y transporte de muestras de diagnóstico veterinario NY/T564-2016 Tecnología de diagnóstico de pasteurelosis porcina 3 principios Diseñar un par de cebadores específicos basados en la secuencia genética de Pasteurella multocida para utilizar Pasteurella multocida El ácido nucleico del ADN del Los bacilos se utilizan como plantilla para amplificar el fragmento de ADN objetivo específico. Los fragmentos de ADN amplificados se someten a electroforesis en gel de agarosa y los resultados se juzgan en función del tamaño de las bandas de ADN. 4 Reactivos o materiales A menos que se especifique lo contrario, todos los reactivos utilizados son de calidad analítica. 4.1 Agua: GB/T6682, Nivel 1. Placa de sangre de oveja al 4,25% 4,3 Tinción de Gram 4,42×TaqMasterMix4.5DNAMarkerDL20004.6 Agarosa 4.7TAE tampón 4.84SGreenPlus colorante de ácido nucleico no tóxico T/SDAA0045-20215 Instrumentos y equipos 5.1 Cabina de seguridad biológica: equipada con filtro de aire de ultra alta eficiencia ULPA. 5.2 Centrífuga refrigerada de alta velocidad: la velocidad de rotación no es inferior a 12000 rpm/min. Instrumento 5.3PCR: la velocidad máxima de aumento de temperatura y enfriamiento es de 4 ℃/segundo, y el rango de temperatura es de 4 ℃ ~ 99 ℃. 5.4 Generador de imágenes en gel: La resolución de la imagen no es inferior a 5 millones de píxeles y la sensibilidad puede detectar menos de 20 pg de ADN bicatenario teñido con EB. 5.5 Medidor de transmitancia ultravioleta: La longitud de onda de la fuente de luz ultravioleta transmitida es de 302 nm. 5.6 Instrumento de electroforesis, rango de salida de voltaje constante: 3 ~ 300 V, rango de salida de corriente constante: 1 ~ 400 mA, rango de salida de potencia constante: 1 ~ 120 W. 6 Las muestras se recolectan y almacenan de acuerdo con las regulaciones de NY/T541. 7 Pasos de la prueba 7.1 Aislamiento y cultivo puro de bacterias 7.1.1 En la cabina de seguridad biológica, utilice un asa de inoculación para inocular la sangre del corazón estéril de los animales enfermos directamente en la placa de sangre de oveja. Para los pulmones, el hígado o el bazo recolectados, use una cuchilla al rojo vivo con una lámpara de alcohol para cauterizar la superficie de los pulmones, el hígado o el bazo, y use tijeras quirúrgicas esterilizadas para cortar una pequeña abertura en el sitio cauterizado. Queme el asa de inoculación con la llama de una lámpara de alcohol. Después de enfriar, inserte el asa de inoculación en los pulmones y otras partes interiores desde la pequeña abertura del material enfermo. Tome una pequeña cantidad de tejido e inocúlelo con rayas al 5%. plato de sangre de oveja. Las placas inoculadas se etiquetaron y se colocaron en un termostato, se incubaron a 37°C durante 24 horas y se observó el tamaño de la colonia, morfología, estado de hemólisis, etc. 7.1.2 Las colonias de Pasteurella multocida porcina son redondas, con bordes limpios, superficies lisas y mucosas y un tamaño de aproximadamente 1 mm a 1,5 mm. Para conocer la morfología de las colonias, consulte el Apéndice A.1. 7.2 Tinción de Gram y microscopía 7.2.1 Tome un portaobjetos de vidrio limpio, utilice un asa de inoculación para enganchar un anillo de solución salina fisiológica estéril y aplique una película de agua con un diámetro de 1 cm sobre el portaobjetos de vidrio. Elija una sola colonia y aplíquela uniformemente en la película de agua, séquela a temperatura ambiente y fíjela con una llama. Realizar tinción de Gram. 7.2.2 Agregar gota a gota la solución de tinte violeta cristal, teñir durante 1 a 2 minutos, enjuagar lentamente con agua corriente y secar; 7.2.3 Agregar solución de yodo de gramo gota a gota, teñir durante 1 a 2 minutos, enjuagar lentamente con agua corriente y secar ; 7.2.4 Agregue etanol al 95% gota a gota, decolore durante 10 a 30 segundos, enjuague lentamente con agua corriente y seque; agregue solución de contratinción gota a gota a T/SDAA0045-20217.2.5, contratiñe durante 1 minuto, enjuague lentamente con agua corriente y secar naturalmente. 7.2.6 El examen microscópico mostró que Pasteurella multocida era bacilos o cocos cortos Gram-negativos. Para la morfología bacteriana, consulte el Apéndice A.2. 7.3 Detección por PCR 7.3.1 La preparación de la plantilla de ADN genómico bacteriano se realizó de acuerdo con NY/ T564-2016 Prepare según lo especificado en 4.4.4. 7.3.2 Amplificación por PCR 7.3.2.1 Cebadores De acuerdo con la secuencia del gen 16SrRNA de Pasteurella multocida (ver Apéndice A.3), diseñar un par de cebadores y sintetizarlos comercialmente. La secuencia de cebadores se muestra en el Apéndice B.1. 7.3.2.2 Sistema de reacción de PCR Reacción de PCR El sistema es un sistema de 25 μL, consulte el Apéndice B.2 7.3.2.3 Condiciones de reacción de PCR El tubo de reacción de muestra se centrifugó a 2000 rpm/min durante 1 min y se colocó en un amplificador de PCR para su amplificación. Las condiciones de la reacción de PCR fueron: predesnaturalización a 94°C durante 5 min, desnaturalización a 94°C durante 30 s, hibridación a 53°C durante 30 s, extensión a 72°C durante 30 s, 32 ciclos de amplificación y final. extensión a 72°C durante 10 min para finalizar la reacción. Al mismo tiempo, se establecieron controles positivos (cepa estándar) y negativos (agua esterilizada) para Pasteurella multocida. Los productos de amplificación por PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% y el tamaño de las bandas de ADN amplificadas se observó con un transiluminador UV o un generador de imágenes en gel. 7.4 La electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR se realizará de acuerdo con NY/T564-20164.4.6. 7.5 Juicio de resultados 7.5.1 Las condiciones para el establecimiento de la prueba se basan en el tamaño de la banda de ADN en DL2000DNAMarker. Cuando el control positivo amplifica un fragmento de aproximadamente 355 pb y el control negativo no amplifica el fragmento, se establece el resultado de la prueba. Los resultados de la electroforesis de ácido nucleico se muestran en el Apéndice B.3. 7.5.2 Si la determinación positiva cumple con las condiciones de 7.5.1 y se amplifica un fragmento de aproximadamente 355 pb de la muestra analizada, se determinará que la bacteria analizada es Pasteurella multocida. . T/SDAA0045-20217.4.5.3 Cuando el juicio negativo cumple con las condiciones de 7.5.1 y la muestra analizada no amplifica un fragmento de aproximadamente 355 pb, se determina que la bacteria analizada no es Pasteurella multocida.

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• 2021 T/SDAA 0045-2021 Detección de Pasteurella multocida mediante PCR