5. Requisitos técnicos: La inoculación debe realizarse de forma aséptica para evitar la contaminación por bacterias diversas. Inspección regular Durante el cultivo de cepas bacterianas, verifique periódicamente la temperatura y la humedad de la incubadora en la que se cultivan las cepas bacterianas; revise los tapones de algodón, las tapas y los medios de cultivo de los recipientes de cultivo para detectar crecimiento de moho. Si se encuentra alguna anomalía, inmediatamente Saque el tubo y vuelva a purificarlo. Después del cultivo, rellene los huecos, compruebe si hay ácaros y otras plagas bajo un microscopio de disección de baja potencia y elimínelos a tiempo cuando los encuentre. 6 Métodos y Procedimientos Las bacterias generalmente se dividen en 3 niveles. Las especies de nivel 1 también se denominan especies madre o especies de probeta. La especie madre puede obtenerse mediante aislamiento de tejido o aislamiento de esporas. Las especies de nivel 2, también llamadas especies originales, son cepas producidas al insertar el micelio de la especie madre en el medio de cultivo de aserrín. Las especies de nivel 3 también se llaman especies cultivadas, que son cepas que se producen multiplicando las especies originales, se utilizan directamente para la producción, por lo que también se les llama especies de producción. Después de la continua expansión y propagación de las especies madre - especies originales - especies cultivadas, la cantidad de micelio aumentará y se hará cada vez más fuerte. Si dicho micelio se pone en producción, se pueden cultivar excelentes cuerpos fructíferos. Producción de semilla madre 6.1.1 Preparación del medio de semilla madre Utilice medio enriquecido con PDA para preparar el medio de semilla madre. La fórmula es: 200 g de papa, 20 g de glucosa, 20 g de agar, KH2PO41,5 ~ 2 g, MgSO40,5 ~ 1 g, 10 g de peptona, agua 1000mL. Método de preparación: Pelar 200 g de patatas, quitarles los brotes, cortarlas en tiras pequeñas y ponerlas en una olla de aluminio. Añadir 1000 ml de agua y 20 g de cáscaras de semillas de algodón. Hervir durante unos 20-30 minutos hasta que las patatas estén crujientes pero no podridas. Utilice 6 - Filtrar a través de 8 capas de gasa, llevar el jugo filtrado a una olla, agregar 20g de glucosa, 1,5~2g de KH2PO4, 0,5~1g de MgSO4, 10g de peptona, agregar agua hasta 1000mL, agregar agar para derretir y distribuir. en tubos de ensayo mientras están calientes. Utilice el diámetro del tubo de ensayo: 2 cm, la longitud óptima es de 20 cm. Utilice un embudo para distribuir el medio de cultivo preparado en los tubos de ensayo. La boca y las paredes del tubo de ensayo deben llenarse con medio de cultivo antiadherente y taparse con tapones de goma o de algodón. Agrupe cada 7 tubos en un paquete, envuelva la boca del tubo con papel kraft, colóquelo en posición vertical en el recipiente de esterilización y esterilícelo a 121 °C y 0,11 ~ 0,15 MPa durante 30 minutos. Después de que el medio de cultivo se enfríe a 60 ~ 70 ° C, colóquelo en un plano inclinado. La longitud debe representar preferiblemente aproximadamente 2/3 de la longitud de la tubería y debe usarse para enfriar. 6.1.2 Aislamiento de cepas bacterianas y cultivo en tubo de transferencia. Los métodos de aislamiento de cepas bacterianas incluyen el método de aislamiento de esporas, el método de aislamiento de tejidos y el método de aislamiento de micelio. El método para aislar las esporas es utilizar orejeras frescas y libres de contaminación bacteriana del año, preferiblemente negras, gruesas y grandes, enjuagarlas con agua esterilizada varias veces, colgar el lado ventral de las orejeras hacia abajo con seda. hilo y se cuelga el otro extremo del recipiente. Se sella la boca del matraz Erlenmeyer con medio de cultivo con un tapón de algodón y se reciben las esporas y se cultivan hasta formar micelio en una incubadora a 25-28°C. El método de separación de tejidos consiste en utilizar audífonos de alta calidad, limpiar la superficie con bolas de algodón con alcohol al 75% de 2 a 3 veces, envolver los audífonos con algodón con alcohol durante aproximadamente 2 minutos y cortar aproximadamente 0,2 centímetros cuadrados del tendón. parte libre de la base de la oreja. En condiciones estériles, insértelo en el medio de cultivo inclinado del tubo de ensayo y cultívelo a una temperatura de aproximadamente 25 a 28 ° C para hacer crecer el micelio. El método de aislamiento de micelio es un método para separar el micelio de los segmentos de madera del hongo negro para obtener cepas bacterianas. Corte un trozo de madera del tamaño de la cabeza de una cerilla, esterilícelo, insértelo en la pendiente del tubo de ensayo en condiciones estériles y luego cultívelo a 25-28 °C para que crezca el micelio. Las especies madre de tubo de ensayo aisladas con éxito también se pueden expandir y multiplicar de 1 a 3 veces en el medio inclinado del tubo de ensayo. Este proceso se llama transferencia de tubo o expansión de tubo, también llamado subcultivo. Generalmente, 1 semilla madre se puede convertir en 30 a 40 semillas madre para satisfacer las necesidades de producción. Cultivo en tubo de transferencia: cuando la temperatura del medio de cultivo descienda por debajo de 30 ° C, inocúlelo en la habitación estéril. Utilice un gancho de inoculación para insertar las bacterias en el medio de cultivo inclinado en blanco de forma rápida y precisa. Al cortar las cepas, elija una parte alejada de las cepas antiguas originales. Generalmente, los dos extremos del medio de cultivo tienen la actividad más fuerte. El tamaño del bloque de cepas es de 1 a 2 mm. Cuanto más pequeño sea el bloque, más consistente la edad de las bacterias. Al separar cepas y transferir tubos para cultivo, las operaciones asépticas deben realizarse en una mesa de trabajo limpia para evitar la contaminación por bacterias diversas. Unos días después de la separación o transferencia, crecerán hifas blancas y esponjosas del hongo negro en la pendiente del tubo de ensayo. Después de unos 10 días de cultivo, puede crecer por todo el talud el micelio, que es la semilla madre. 6.1.3 Cultivo de semillas madre Las condiciones de cultivo de semillas madre deben cultivarse en una incubadora a temperatura constante (26 ± 1) °C en la oscuridad. El micelio crecerá en aproximadamente 10 días. Durante este período, se requiere observación regular para seleccionar Semillas madre contaminadas o muertas. El crecimiento micelial es fuerte, blanco, uniforme y libre de contaminación bacteriana, lo cual es una buena cepa. Preparación del stock 6.2.1 Preparación del medio de cultivo (1) Fórmula del medio. La fórmula media es 78% cáscaras de semillas de algodón, 20% salvado de trigo, 1% sacarosa y 1% yeso. (2) Método de preparación. Mezcle las cáscaras de las semillas de algodón, el salvado de trigo y el yeso de manera uniforme y luego agregue agua para que el contenido de humedad del material de cultivo alcance aproximadamente el 60%. El método de medición consiste en sujetar firmemente el medio de cultivo con las manos y debe quedar una ligera marca de agua entre los dedos, pero sin gotear. (3) Embotellado y ensacado medio. Las botellas de inóculo se utilizan para la producción de material. Una vez preparado el medio de cultivo, se puede colocar en un matraz Erlenmeyer, llenarlo hasta el borde del matraz y aplanar la superficie del material. El material de cultivo se debe apretar y aflojar en la botella, y se debe usar un punzón de madera para hacer un agujero en el medio. Limpie el interior y el exterior de la boca de la botella y séllela con un tapón de algodón o goma. (4) Esterilización media. La especie original se embotella y luego se coloca en cestas de hierro o de plástico para su esterilización. El método de esterilización utiliza esterilización con vapor a alta presión. Cuando se utiliza la esterilización por vapor a alta presión, la olla se esteriliza bajo una presión de 0,15 MPa (la temperatura en la olla es de 127°C) durante 1,5 horas. 6.2.2 Inoculación de la semilla original La semilla original es la cepa bacteriana obtenida al expandir la cepa madre en el medio de cultivo original. Después de que la botella o bolsa de inoculación esterilizada se traslade a un banco de trabajo limpio o sala de inoculación para la inoculación, después de que la temperatura del material caiga por debajo de 30°C. Antes de la vacunación, traslade el equipo y los artículos de vacunación al lugar de vacunación. Estos utensilios y artículos incluyen principalmente cucharas de vacunación, pinzas, lámparas de alcohol, bolas de algodón con alcohol, cepas bacterianas y bolsas para inocular. Después de guardar los artículos, use luz ultravioleta o desinfectante en aerosol para fumigar y desinfectar, y espere 40 minutos antes de usarlos. Al inocular, primero encienda la lámpara de alcohol, limpie los utensilios de inoculación, la superficie bacteriana y las manos del inoculador con alcohol al 75%, luego queme la aguja de inoculación, las pinzas y los tapones de algodón bacterianos en la llama para esterilizarlos y luego queme el tubo sobre la llama. Retire con cuidado el tapón de algodón/goma de la boca del (frasco) y sosténgalo en diagonal hacia la llama para proceder con la vacunación formal. Al inocular las semillas originales, use una aguja de inoculación para dividir la pendiente de cada semilla madre en 4-5 secciones e inserte un segmento en cada botella del medio de cultivo de semillas original; al inocular las semillas cultivadas, use unas pinzas para insertar una pequeña pedazo de la semilla original en cada botella de medio de cultivo. Semilla, es decir, cada botella de semilla original generalmente se puede usar para cultivar 30-40 botellas o 40-50 botellas. 6.2.3 El sitio de cultivo original también debe fumigarse y desinfectarse con desinfectantes en aerosol antes de su uso. (1) Temperatura de cultivo: generalmente colocada a una temperatura de 22°C-25°C, la botella puede crecer completamente en 25-60 días. (2) Humedad del cultivo: la humedad relativa interior se mantiene entre 60% y 70%, y el aire interior siempre se mantiene fresco para facilitar el crecimiento del micelio. Si la humedad del aire interior es demasiado alta, espolvoree un poco de cal en polvo en el suelo para reducir la humedad y evitar la reproducción de plagas y enfermedades. (3) Coloque las botellas de cepas en posición vertical: dado que los bloques de cepas insertados aún no han crecido ni se han fijado, si se colocan boca abajo, los bloques de cepas caerán fácilmente al costado de la botella, afectando la germinación de las cepas. Si la cantidad de cepas producidas es grande, el micelio debe germinarse y sellarse, y luego se pueden apilar boca abajo para aprovechar al máximo el espacio. (4) Inspección y eliminación de impurezas: desde el comienzo de la germinación bacteriana y el sellado de la colonización, es necesario verificar con frecuencia si hay contaminación por bacterias extrañas. Si se encuentran bacterias extrañas, deben detectarse a tiempo. Generalmente, el El trabajo de inspección continúa hasta que el micelio cubre toda la superficie del medio de cultivo. (5) Mantener limpio e higiénico: Mantener limpio e higiénico dentro y fuera de la sala de cultivo. Al mismo tiempo, cada 7-10 días durante el período de cultivo, rocíe diclorvos al 1% u otro líquido insecticida en interiores y exteriores y en el tapón de la botella. para evitar que se produzcan plagas. Una vez cultivadas las cepas, guárdelas en un lugar limpio, seco y a baja temperatura, lejos de la luz, hasta que estén listas para su uso. Preparación de especies cultivadas Las especies de cultivo son cepas que se obtienen expandiendo la especie original en el medio de cultivo del cultivar. 6.3.1 Preparación del medio de cultivo para especies cultivadas La fórmula y el método de producción del medio de cultivo para especies cultivadas son los mismos que para las especies originales, pero las especies cultivadas generalmente se producen en bolsas de plástico y las bolsas de polipropileno son adecuadas para vapor a alta presión. esterilización. El tamaño de la bolsa es de 36 cm x 16,2 cm x 0,005 cm. Al ensacar, asegúrese de que esté bien apretado, después del ensacado, utilice una máquina ensacadora para hacer el ensacado e insertar la varilla de inoculación. Al ensacar, las bolsas deben manipularse con cuidado para evitar que la arena o los desechos las perforen y causen contaminación. Después de embolsar el medio de cultivo, se coloca en una bandeja de plástico y se coloca en un recipiente de autoclave grande bajo una presión de 0,14 MPa y una temperatura de 121°C durante 3,5 horas. 6.3.2 Inoculación de especies cultivadas El método de inoculación de especies cultivadas es consistente con el de las especies originales. 6.3.3 Cultivo de especies cultivadas El cultivo de especies cultivadas es consistente con las especies originales, pero no es adecuado para expandir el cultivo de las especies cultivadas. Procedimientos de operación de inoculación aséptica Las operaciones asépticas generalmente se realizan en un banco de trabajo limpio o en una sala de inoculación. Cuando la carga de trabajo es pequeña, se utiliza un banco de trabajo limpio. Cuando la carga de trabajo es grande, como la producción de semillas cultivadas, es necesario realizarla en la inoculación. habitación. Los pasos operativos son los siguientes: 6.4.1 Instrucciones para el uso del banco de trabajo ultralimpio Primero, limpie el banco de trabajo ultralimpio y la sala de inoculación, y coloque medios de cultivo, cepas bacterianas y equipos de inoculación. Utilice luz ultravioleta para esterilizar la mesa de trabajo ultralimpia durante 30 minutos. Las bacterias deben cubrirse con periódico para evitar que la luz ultravioleta las mate. Para fumigación y desinfección de la sala de inoculación utilizar polvo desinfectante en aerosol, utilizar 1 paquete (5 gramos) por metro cúbico de espacio, colocarlo en un recipiente y encenderlo, y conservarlo por más de 40 minutos. Límpiate las manos con un algodón con alcohol al 75%. Encienda la lámpara de alcohol y queme y esterilice los instrumentos de vacunación antes de iniciar la vacunación. Se debe mantener una operación aséptica durante la inoculación. Una vez inoculado el medio de cultivo, se traslada a la sala de cultivo para su cultivo. 6.4.2 Instrucciones para usar la sala de inoculación ① Una hora antes de cada uso, mueva los elementos necesarios a la sala de inoculación, colóquelos en una posición determinada y verifique si están completos. Después de rociar la sala de inoculación y la sala de amortiguamiento con una solución de ácido carbólico al 5%, encienda la lámpara ultravioleta durante 40 minutos; ② Apague la lámpara ultravioleta y entre a la sala de amortiguamiento después de 20 minutos, póngase ropa de trabajo, zapatos, máscaras y gorros de trabajo y luego use 2 Remoje sus manos en jabón con % de ácido carbólico durante 2 minutos; ③ Ingrese a la sala de inoculación y rocíe una solución de ácido carbólico al 5 % en la parte superior del banco de trabajo y el suelo cercano. ④ Antes de la inoculación, límpiese las manos con bolas de algodón con alcohol al 75% y luego realice varias operaciones sobre la llama como de costumbre. Los movimientos deben ser ligeros y ágiles durante la operación para minimizar las fluctuaciones del aire, y las dos personas deben cooperar tácitamente durante la operación. No arroje cerillas usadas ni papel usado al suelo, colóquelos en contenedores especiales; ⑤ Una vez completado el trabajo, saque los materiales de inoculación a tiempo, luego limpie la mesa, saque los desechos de la habitación y luego rocíe. con ácido carbólico al 5%, o abra la Irradie la lámpara UV durante media hora; ⑥Si el tapón de algodón se incendia durante la vacunación, sosténgalo firmemente con las manos para apagarlo, o apáguelo con un paño húmedo. No sople Sáquelo con la boca para evitar expandir la llama. Si el recipiente de cultivo o bacteriano está roto y esparcido, debe usar de inmediato un trapo humedecido en una solución de ácido fénico al 5%, limpiarlo y luego limpiarse las manos con un algodón con alcohol antes de continuar con la operación.
T/SYJ 0003-2023 Historia
2023T/SYJ 0003-2023 Technical regulations for the production of black fungus solid strains