T/CSBM 0022-2022
Método de evaluación de la degradación, osteogénesis y respuesta tisular del metal degradable a base de Mg en el sitio del implante. (Versión en inglés)

Estándar No.

T/CSBM 0022-2022

Idiomas

Chino, Disponible en inglés

Fecha de publicación

2022

Organización

Group Standards of the People's Republic of China

Ultima versión

T/CSBM 0022-2022

Alcance

Diseño experimental 1.1 Descripción general Este método consiste en implantar implantes óseos médicos degradables a base de magnesio en el tejido óseo de animales de prueba durante un cierto período de tiempo y luego utilizar imágenes y tejido en diferentes momentos del proceso. Se utilizó un examen científico, combinado con un análisis cuantitativo de imágenes, para evaluar el rendimiento de degradación, la capacidad osteogénica y la reacción del tejido local después de la implantación de implantes óseos metálicos degradables a base de magnesio. Nota: Antes de realizar la prueba de degradación in vivo, se recomienda realizar un análisis cualitativo y cuantitativo del implante de acuerdo con los requisitos de GB/T 16886.15. 1.2 Preparación de muestras 1.2.1 Muestras de prueba 1.2.1.1 Las propiedades físicas de las muestras de prueba (como la forma, la rugosidad de la superficie, etc.) pueden afectar el rendimiento de degradación del material. 1.2.1.2 Cada muestra de prueba deberá someterse a los mismos procesos de fabricación, manipulación, limpieza, esterilización y envasado que el producto final. 1.2.1.3 Después de la preparación y esterilización de la muestra, se debe tener especial cuidado de no causar rayones, daños o contaminación antes o durante la implantación. 1.2.2 Para muestras de referencia, considere seleccionar materiales que ya estén en el mercado y que actualmente no estén reconocidos como adecuados para comparaciones de metales a base de magnesio degradables, o materiales que sean consistentes con el uso previsto del candidato a base de magnesio degradable. metal y han sido clínicamente probados. Se aceptaron materiales similares para evaluar el grado de reacción histológica local después de la implantación y comparar la tasa de degradación y la tasa de formación de hueso nuevo de los materiales. 1.2.3 Forma de la muestra La muestra implantada se puede procesar en forma cilíndrica, en forma de tornillo o grabada con roscas. 1.2.4 Tamaño de la muestra El tamaño de la muestra implantada se determina en función del tamaño del animal seleccionado y su tejido óseo. Nota: En principio se debe consultar la normativa GB/T 16886.6-2015. Se recomienda implantar en la tibia o fémur del conejo, utilizando un cilindro de 2 mm de diámetro y 6 mm de altura. 1.3 Animales de experimentación y sitios de implantación 1.3.1 Animales de experimentación 1.3.1.1 Los animales de experimentación deben seleccionarse y criarse de acuerdo con GB/T16886.2 y las regulaciones nacionales sobre animales de experimentación. Los animales de experimentación deben tener libre acceso a alimentos y agua. 1.3.1.2  La prueba de implantación intraósea lleva mucho tiempo. Generalmente se prefieren conejos de Nueva Zelanda, con un peso no inferior a 2,5 kg. La coneja debe ser infértil. 1.3.1.3 Se debe seleccionar un número suficiente de animales para garantizar que se puedan obtener al menos 10 muestras de prueba y 10 muestras de referencia para cada ciclo de prueba para cada examen (descalcificación y no descalcificación). 1.3.2 Sitio de implantación 1.3.2.1 Se recomienda consultar las disposiciones de GB/T 16886.6-2015 para seleccionar la tibia o el fémur de conejo como sitio de implantación. Sitios de uso clínico simulados u otros adecuados. También se pueden considerar sitios. Nota: Los sitios de uso clínico simulados u otros sitios adecuados deben cumplir con los requisitos de análisis de 7.1.2. 1.3.2.2 La muestra de prueba y la muestra de referencia (si la hay) deben implantarse en el mismo sitio anatómico en ambos lados del mismo animal en las mismas condiciones. Al seleccionar el sitio de implantación, se debe garantizar que la operación de implantación no cause fracturas patológicas en el sitio de prueba. En animales jóvenes, se deben evitar los implantes en la región epifisaria u otros huesos inmaduros. 1.4 Período de prueba 1.4.1 El período de prueba debe determinarse en función del uso previsto y el rendimiento de degradación de la muestra de prueba. Antes de realizar pruebas in vivo con animales, se debe evaluar de antemano el tiempo de degradación de la muestra de prueba, que se puede calcular mediante pruebas de degradación in vitro o modelos matemáticos en entornos específicos. En principio, el ciclo de prueba debe establecerse para al menos (pero no limitarse a) tres períodos de observación, que generalmente deben ser más largos que el tiempo de degradación y absorción de la muestra de prueba, o el ciclo de prueba debe poder permitir el correspondiente reacción del tejido para alcanzar un estado estable. Por lo general, se deben establecer al menos (pero no limitado a) los siguientes tres puntos de tiempo: a) Ninguna o solo una cantidad muy pequeña de degradación; b) El proceso de degradación, se recomienda incluir el punto de tiempo en el que la cantidad restante de la implante es aproximadamente del 50%; c) La reacción del tejido se encuentra en un estado estable o el implante está casi completamente degradado. 1.4.2 La tasa de degradación de los implantes y los cambios en la estructura del tejido circundante cambian con el tiempo. Para materiales que se espera que se degraden casi por completo en 12 semanas, se recomienda seleccionar 1 semana, 4 semanas y 12 semanas como períodos de observación. 1.4.3 Para los materiales que se espera que se degraden por completo o alcancen un estado estable de degradación durante 12 semanas, se pueden consultar los principios anteriores y seleccionar el período de prueba en función de las características de degradación del implante. 2 Método de prueba 2.1 Proceso quirúrgico 2.1.1 Bajo anestesia y condiciones estériles, realizar el siguiente proceso quirúrgico de acuerdo con los requisitos quirúrgicos convencionales: a) Preparar la piel del fémur lateral o tibia medial, desinfectar y cubrir; b) Cortar la piel, separar el tejido subcutáneo y exponer la corteza ósea a lo largo del espacio muscular; c) Taladrar agujeros de forma intermitente a baja velocidad, mientras se lava con solución salina para enfriar. Para la tibia o fémur, taladre 2 orificios y hasta 3 orificios en un lado, con una profundidad cercana a la longitud del implante, un diámetro de orificio de 2 mm y una distancia no inferior a 10 mm entre los dos orificios; d)   Retirar los restos óseos; e)  Presionar suavemente la muestra a implantar de modo que la superficie de la muestra quede plana o ligeramente más baja que la superficie de la corteza ósea, y el implante roscado se atornilla en el orificio; f) Suture los músculos, la fascia y la piel capa por capa. 2.1.2 La muestra de referencia se opera de la misma manera que el lado contralateral. 2.2 Observación clínica posoperatoria 2.2.1 La reacción de la piel del sitio de implantación debe observarse todos los días dentro de las 2 semanas posteriores a la implantación, para detectar anomalías como sangrado, enrojecimiento, hinchazón, enfisema y secreción del implante. . 2.2.2 Observe el estado de salud de los animales con regularidad durante el período de prueba y registre cualquier hallazgo anormal, incluidas reacciones locales y comportamientos anormales. 2.2.3  Registrar el número de animales muertos y realizar necropsia oportunamente, los animales moribundos son aislados y sacrificados oportunamente. 2.3 Sacrificio de animales: Al final del período de observación, los animales serán sacrificados sin dolor con una sobredosis de anestésico. 2.4 Observación general 2.4.1 Observe el tejido en el sitio del implante visualmente o con una lupa de baja potencia y registre la naturaleza y el alcance de la reacción del tejido observada, incluidos hematoma, edema, encapsulación fibrosa, y/o cualquier hallazgo bruto. Registre el estado observable del implante, incluida la morfología de la superficie, la ubicación, la integridad y las condiciones residuales. 2.4.2 Al observar el sitio de implantación, si el animal parece enfermo o tiene una reacción anormal al implante, se debe realizar una necropsia macroscópica si es necesario. 2.5 Recolección de material y preparación de cortes histopatológicos 2.5.1 Requisitos básicos 2.5.1.1 Las muestras de tejido extraídas deben incluir el implante y suficiente tejido no afectado a su alrededor. 2.5.1.2 Los bloques de tejido extraídos se fijaron y se prepararon cortes histopatológicos utilizando dos técnicas de preparación, descalcificación y no descalcificación, para evaluar la reacción histológica local después de la implantación, así como la degradación de materiales y hueso nuevo. La situación generacional. 2.5.2 Preparación de corte histopatológico de rutina (descalcificación) El bloque de tejido óseo que contiene el implante debe colocarse inmediatamente en una solución de formaldehído al 10% y otros métodos de fijación adecuados después de haber sido fijado durante 2 semanas, y luego colocarse en un recipiente de descalcificación adecuado. La descalcificación se realizó en solución, seguida de deshidratación en gradiente de etanol, transparencia de xileno e inclusión en parafina. Las secciones patológicas se realizaron de forma rutinaria perpendicular al eje longitudinal del implante y se tiñeron con HE. Nota: Solución de descalcificación como EDTA. 2.5.3 Preparación de cortes patológicos de tejido duro (sin descalcificación) 2.5.3.1 El bloque de tejido óseo que contiene el implante debe fijarse inmediatamente en alcohol al 70% durante 1 a 2 semanas después de ser recolectado y luego deshidratarse con gradiente alcohol, se hizo transparente con xileno, se infiltró con solución de metacrilato de metilo durante 1 semana y se embebió con polimetacrilato de metilo. Después del curado, se seccionaron secciones perpendiculares al eje longitudinal del implante dentro del área fibrosa del hueso cortical utilizando un micrótomo de tejido duro. Esmerilar y pulir hasta un espesor de 50 μm ± 10 μm y finalmente teñir con fucsina ácida VG o utilizar otros métodos de tinción adecuados. 2.5.3.2 Al mismo tiempo, tome una muestra de prueba no implantada e inclúyala con polimetilmetacrilato. Después del curado, use un microtomo de tejido duro para cortar perpendicular al eje largo de la muestra de prueba, y muela y pula hasta obtener un El espesor es de 50 μm ± 10 μm y se utiliza para calcular el área de la sección transversal total del implante antes de la implantación. Nota: Al realizar secciones de tejido, corte el área del hueso cortical en cada punto de implantación. 2.6 Si es necesario, se puede utilizar el examen de imágenes Micro-CT para analizar la degradación tridimensional de los implantes metálicos. De acuerdo con las condiciones del equipo, seleccione el voltaje, la corriente y el tiempo de exposición adecuados, y el tamaño de píxel efectivo no debe ser bajo A 10 μm. Se utiliza el software correspondiente para calcular el volumen de metal restante degradado y de hueso recién formado. 3 Evaluación de resultados 3.1 Rendimiento de degradación y osteogénesis 3.1.1 El análisis cualitativo utiliza secciones de tejido duro no descalcificado y observa bajo un microscopio óptico si el implante se degrada y se forma hueso nuevo en el sitio de implantación. y Observar y describir la madurez del hueso nuevo, como el hueso tejido, el hueso laminar y la médula ósea. 3.1.2 Análisis cuantitativo 3.1.2.1 Análisis de la cantidad restante del implante y la cantidad de formación de hueso nuevo 3.1.2.1.1 Utilice un microscopio óptico para recopilar imágenes de cada corte de muestra de prueba y utilice el Sistema de análisis de imágenes para calcular la implantación. El área transversal total antes de la implantación. Nota: Se recomienda utilizar el software ImageJ para el análisis. 3.1.2.1.2 Utilizando secciones de tejido duro no descalcificado, primero seleccione el área de implantación para que sea igual al área de la sección transversal total antes de la implantación, y luego seleccione el material residual o hueso nuevo que debe evaluarse en esta área. tejido, y finalmente analizar cuantitativamente la cantidad restante del implante y la cantidad de formación de hueso nuevo, y calcular la tasa de degradación del implante y la tasa de formación de hueso nuevo. Nota: El área de implantación está sujeta a un único campo de visión microscópico que puede cubrir completamente toda el área de implantación. 3.1.2.1.3 Calcular la tasa de degradación del implante (DR) según la fórmula (1): DR(%)=(1-RMV/IMV)×100%………………(1) Donde: DR ——tasa de degradación del implante; RMV——cantidad restante de implante; IMV——cantidad inicial de implante. 3.1.2.1.4 Calcular la tasa de formación de hueso nuevo (RNBF) según la fórmula (2): RNBF(%)=NBFV/IMV×100%………………(2) Donde: RNBF————Nuevo Tasa de formación ósea; NBFV - volumen de formación de hueso nuevo; IMV - volumen inicial del implante. 3.1.2.2 La tasa promedio de degradación del implante se calcula de acuerdo con la fórmula (3): P1 = DEG/10……………………(3) donde: P1————La tasa promedio de degradación del implante; DEG————La suma de las tasas de degradación del implante en cada punto de implantación. 3.1.2.3 La tasa promedio de formación de hueso nuevo se calcula de acuerdo con la fórmula (4): P2=SRNBF/10……………………(4) Donde: P2———— —La tasa promedio de formación de hueso nuevo ; SRNBF: la suma de las tasas de formación de hueso nuevo en cada sitio de implante. 3.2 Reacción histológica local 3.2.1 Observación histológica (cualitativa) 3.2.1.1 Utilice secciones de tejido duro descalcificado para observar y comparar la reacción del tejido alrededor de la muestra de prueba y la muestra de referencia bajo un microscopio óptico. Al menos los indicadores que deben observarse deben incluir: a) La formación de espacio aéreo alrededor del implante; b) La formación de tejido de granulación, fibrosis y cavidad fibroquística; c) El grado de reacción inflamatoria: 1)   Congestión inflamatoria; 2) El número, distribución y tipo de infiltración de células inflamatorias. Nota: Las células inflamatorias incluyen neutrófilos, linfocitos, células plasmáticas, macrófagos y células gigantes multinucleadas. d) La existencia, alcance y grado de degeneración y necrosis tisular; e) Distribución de los vasos sanguíneos, infiltración grasa y formación de nuevo hueso. 3.2.1.2 Utilizando cortes de tejido duro no descalcificado, los indicadores observados al microscopio óptico deben incluir: a) la rotura del material y/o la presencia de fragmentos, la forma y ubicación de los residuos de degradación del material; b) los residuos de degradación del material; b) ; La interfaz entre el implante y el tejido circundante; c) La formación de espacios de aire en el tejido que rodea el material. 3.2.2 La clasificación semicuantitativa de la reacción histológica se basará en el sistema de puntuación de reacciones histológicas del Apéndice E de GB/T 16886.6-2015, y las secciones de tejido de la muestra de prueba se calificarán por separado. 3.3 Análisis de imágenes Si es necesario, utilice un software de soporte para analizar el volumen de metal restante y dibujar un volumen de implante de metal y una curva de tiempo. Calcule la proporción (△V) del volumen de hueso nuevo (V1) con respecto al área del defecto óseo (V0). La fórmula de cálculo es: △V=V1/V0×100%…………………… …… (5) En la fórmula: △V——La proporción del volumen de hueso nuevo con respecto al área del defecto óseo; V1——El volumen de hueso nuevo; V0——El volumen del defecto óseo. Nota 1: El volumen del defecto óseo (V0) generalmente se refiere al volumen antes de la reparación del defecto óseo o la preparación del defecto óseo. Puede calcularse en función del tamaño del defecto o calcularse con referencia al control en blanco. Nota 2: El volumen de hueso nuevo (V1) se refiere a la parte del área del defecto óseo donde el valor de gris está dentro de un rango determinado. El rango de valor de gris de hueso nuevo debe definirlo usted mismo. Diferentes equipos, diferentes parámetros de disparo, diferentes tamaños de muestras de disparo y sitios de implantación, diferentes valores radiopacos de los materiales del implante y diferentes valores de cenizas de hueso nuevo, por lo tanto, la interferencia de los materiales restantes debe minimizarse al calcular el volumen de hueso nuevo. 4 Informe de prueba El informe de prueba debe incluir datos detallados para permitir una evaluación independiente de los resultados. El informe de la prueba debe indicar la institución de prueba y la fecha de la prueba, y se deben informar los siguientes elementos: a) Procedimientos de procesamiento, incluidas las técnicas de limpieza, manipulación y esterilización utilizadas (si corresponde). Nota: Si la muestra no se prepara en este laboratorio, el fabricante debe proporcionar esta información antes de comenzar la prueba. b) Animales e implantes 1) La especie, cepa, origen, edad, sexo y peso del animal, las condiciones ambientales durante el período de prueba, la dieta y la condición del animal, y todas las observaciones durante el período de prueba, incluidas muerte accidental Descubrimiento; 2) Método de implantación y número de implantes por animal y por sitio. c) Muestreo y preparación histológica: 1) Método de muestreo utilizado, registrar el número de implantes tomados de cada animal y cada período de observación; Nota: Todas las muestras deben incluirse como parte de la prueba. 3) Observación general del lugar de implantación y de la tecnología de preparación del corte histológico utilizada. d) Observaciones desnudas y microscópicas: 1) Observación de cada implante y la apariencia general del tejido que rodea al implante; 2) Descripción detallada y evaluación comparativa de las secciones de tejido descalcificado Reacción y reacción histológica calificación; 3) Informe respectivamente el valor promedio general y la desviación estándar de la tasa de degradación del implante, el valor promedio general y la desviación estándar de la tasa de formación de hueso nuevo y los resultados experimentales para la muestra de prueba y la muestra de referencia ( en su caso) Análisis estadístico de resultados de degradación y osteogénesis en grupos y controles, así como cuadros patológicos típicos de madurez ósea nueva. e) Evaluación de resultados: El informe debe incluir una evaluación general de la tasa de degradación, la tasa de formación de hueso nuevo y la respuesta histológica local del sitio del implante óseo de metal a base de magnesio degradable.

T/CSBM 0022-2022 Historia

• 2022 T/CSBM 0022-2022 Método de evaluación de la degradación, osteogénesis y respuesta tisular del metal degradable a base de Mg en el sitio del implante.