1 Alcance Esta norma es aplicable a la determinación de Aspergillus niger en uvas. Esta norma especifica los métodos de prueba para Aspergillus niger en uvas. Este documento es aplicable a la detección de Aspergillus niger en uvas y pasas frescas en Xinjiang. 2 Documentos normativos de referencia Los documentos citados en este documento son esenciales para la aplicación del presente documento. Para los documentos de referencia fechados, solo se aplica a este documento la versión fechada. Para los documentos de referencia sin fecha, se aplica a este documento la última versión (incluidas todas las modificaciones). El laboratorio analítico GB/T 6682 utiliza agua de primer grado especificada. 3 Términos y definiciones 3.1 Uvas frescas Seleccione uvas frescas y limpias que hayan pasado por ciertos tratamientos de procesamiento o conservación. 3.2 Pasas Las pasas se elaboran deshidratando las uvas mediante secado al aire natural o calentamiento artificial. 3.3 Aspergillus niger Aspergillus niger pertenece a las especies comunes de hongos del género Deuteromycotina, Hypomycota, Hypomycetes, Phytophthoraceae y Aspergillus. Es fácil de cultivar y reproducir en grandes cantidades en ambientes de alta temperatura y humedad, principalmente en frutos jugosos, provocando pudrición y deterioro. 4 El número de Aspergillus niger en el medio. 5 Medio y reactivos 5.1 Medio 5.1.1 Agar patata dextrosa (PDA). 5.1.2 Medio de Chad al 2% de almidón. 5.2 Reactivo 5.2.1 Suero fisiológico estéril. 5.2.2 Reactivo I2-Ki (solución de tinción de vitalidad de polen). 6 Cepa estándar 6.1 Cepa estándar de Aspergillus niger 7 Instrumentos y equipos 7.1 Incubadora: 28 ℃ ± 1 ℃. 7.2 Homogeneizador tipo bofetada y bolsa de homogeneización. Balanza electrónica: Sensibilidad: 0,1g. 7.3 Matraz Erlenmeyer estéril: Capacidad: 500mL. 7.4 Pipeta estéril: 1 mL (con escala de 0,01 mL), 10 mL (con escala de 0,1 mL). 7.5 Tubo de ensayo estéril: 18mmx180mm. 7.6 Mezclador Vortex. 7.7 Plato plano estéril: diámetro 90 mm. 7.8 Baño María a temperatura constante: 46°C ± 1°C. 7.9 Microscopio: 10x~100x. 7.10 Micropipeta y punta de pipeta: 1,0 mL. 7.11 Portaobjetos de vidrio de medición de Hao: un portaobjetos de vidrio especial con una cámara de medición estándar. Cubreobjetos. 7.12 Micrómetro: portaobjetos de vidrio con escala estándar. 7.13 Balanza electrónica: sensibilidad 0,01 g. 7.14 Oscilador 8 El programa de detección se muestra en la Figura 1. Figura 1 Procedimiento de inspección y determinación del recuento de Aspergillus niger 8,1 2 minutos para preparar una solución homogénea de muestra 1:10. 8.1.2 Tome 1 ml de solución homogénea de muestra 1:10 e inyéctelo en un tubo de ensayo que contenga 9 ml de diluyente estéril. Utilice otra pajita estéril de 1 ml para soplar y aspirar repetidamente, o mezclar en un mezclador vórtex. Es 1: 100 muestras de solución homogénea. 8.1.3 Siga la operación 5.1.3 para preparar una serie incremental de 10 veces de soluciones homogéneas de muestra diluidas. Para cada dilución incremental, utilice una pipeta estéril de 1 ml. 8.1.4 Según la estimación del estado de contaminación de la muestra, seleccione de 2 a 3 soluciones homogéneas de muestra con diluciones apropiadas. Mientras realiza 10 diluciones incrementales, extraiga 1 ml de la solución homogénea de muestra de cada dilución en 2 muestras libres. el plato. Al mismo tiempo, agregue 1 ml de solución de dilución estéril a 2 placas estériles como controles en blanco. 8.1.5 Vierta inmediatamente de 15 a 20 ml de agar papa dextrosa enfriado a 46 °C (puede mantenerse en un baño de agua seco a temperatura constante de 46 °C ± 1 °C) en un plato plano y gire el plato plano para mezclar uniformemente. Colocar sobre un nivel freático hasta que el medio de cultivo solidifique por completo. 8.2 Después de que el agar de cultivo se solidifique, coloque la placa en posición vertical y cultívela en una incubadora a 28 ° C + 1 ° C. Observe y registre los resultados del quinto día de cultivo. (Nota: si el grado de contaminación es demasiado alto, la observación se puede iniciar el tercer día). 9 Experimentos bioquímicos: elija más de 2 colonias típicas o sospechosas de la placa de agar selectivo para pruebas de identificación. 9.1 Observación de la morfología de las colonias de Aspergillus niger: Las colonias de Aspergillus niger se propagan rápidamente, pero el crecimiento es ligeramente limitado, las hifas son blancas, luego se tornan de color amarillo brillante hasta llegar a un negro espeso aterciopelado, el dorso es incoloro o el centro es marrón ligeramente amarillento. y la parte superior forma una bolsa esférica. Las cabezas de los conidios son esféricas, de 700 a 800 μm de diámetro y de color marrón negruzco. 9.2 Experimento de descomposición del almidón: Experimento de descomposición del almidón: utilice medio Chad con 2% de almidón. Utilice un asa de inoculación para raspar un anillo de esporas de Aspergillus niger purificadas en un matraz cónico que contenga 100 ml de solución salina fisiológica estéril y perlas de vidrio, y agite. Tome 1 mL de suspensión de esporas e inyéctelo en una placa de medio Chad con 2% de almidón y extiéndalo en la placa. Incúbelo boca abajo a 37°C durante 2 días. Agregue reactivo I2-Ki (tinte de viabilidad del polen) al medio y Mida el número de colonias producidas con una regla. Tamaño del círculo transparente y regístrelo. 9.3 Identificación de la producción de ácido cítrico: Utilice un asa de inoculación estéril para raspar suavemente las hifas y esporas de bacterias típicas o sospechosas en agua estéril para preparar una suspensión bacteriana y colóquela en un matraz Erlenmeyer con PDA (Agar Patata Dextrosa). medio de cultivo Agitar bien. Colocar en una coctelera e incubar a 35°C y 200 r/min durante 2 días. Tomar 5 mL de caldo de fermentación en un tubo de ensayo y dejar caer en una solución saturada de CaCO3, si hay un precipitado blanco, prueba que se produce ácido cítrico, Aspergillus niger produce ácido cítrico. 10 El recuento de colonias se basa en la Norma Nacional de Seguridad Alimentaria GB 4789.15-2016 para el recuento de moho y levaduras. Las placas con colonias típicas de Aspergillus niger se seleccionan y expresan en unidades formadoras de colonias (UFC). Seleccione una placa con colonias que oscilen entre 10 UFC y 150 UFC y cuente Aspergillus niger según la morfología de la colonia. Si la colonia crece hasta cubrir toda la placa, se puede registrar como extensión de la colonia. 11 Resultados e informes 11.1 Resultados 11.1.1 Calcule el número promedio de colonias en dos placas con la misma dilución y luego multiplique el valor promedio por el factor de dilución correspondiente. 11.1.2 Si el número de colonias en dos placas de dilución está entre 10 UFC y 150 UFC, el cálculo se realizará de acuerdo con la normativa correspondiente de GB 4789.2. 11.1.3 Si el número de colonias en todas las placas es superior a 150 UFC, cuente la placa con la dilución más alta. Otras placas pueden registrarse como demasiado numerosas para contarlas. El resultado se calcula multiplicando el número promedio de colonias por el número más alto. factor de dilución. 11.1.4 Si el número de colonias en todas las placas es inferior a 10 UFC, el cálculo debe basarse en el número promedio de colonias con la dilución más baja multiplicado por el factor de dilución. 11.1.5 Si la cantidad de colonias en la placa en todas las diluciones no está entre 10 UFC y 150 UFC, y una parte de las placas es de 10 UFC para placas pequeñas o 150 UFC para placas grandes, la cantidad promedio de colonias más cercana a 10 UFC o 150 UFC será multiplicarse por el factor de dilución para el cálculo. 11.2 Informe 11.2.1 El número de colonias se redondea según el principio de "redondeo". Cuando el número de colonias está dentro de 10, se informa con una cifra significativa; cuando el número de colonias está entre 10 y 100, se informa con dos cifras significativas. 11.2.2 Cuando el número de colonias sea mayor o igual a 100, los primeros 3 dígitos se redondearán usando el principio de "redondeo", y se tomarán los primeros 2 dígitos, seguidos de 0 en lugar de dígitos para expresar el resultado; también se puede expresar en forma de exponente de 10 , en este momento, el contrato también fue revisado según el principio de "redondear cinco personas" y utilizando dos cifras significativas. 11.2.3 Si aparecen colonias en la placa de control en blanco, los resultados de la prueba no serán válidos. 11.2.4 El pesaje y el muestreo se informarán en UFC/g.
T/AFFI 039-2023 Historia
2023T/AFFI 039-2023 Determinación de Aspergillus niger en uvas frescas y pasas.