Requisitos para el sitio de producción 4.1.1 Requisitos básicos El ambiente debe estar limpio y ordenado, con buen aire, buena ventilación, suficientes fuentes de agua y cumplir con los estándares de higiene del agua potable GB5749, drenaje suave, suficiente suministro de energía y transporte conveniente. 4.1.2 Los requisitos de saneamiento ambiental deben cumplir con las disposiciones del Reglamento Técnico NY/T528 para la Producción de Hongos Comestibles. Instalaciones y equipos de producción 4.2.1 La configuración y distribución del edificio de la fábrica deben cumplir con las disposiciones del Reglamento Técnico NY/T528 para la Producción de Hongos Comestibles. 4.2.2 La sala de fermentación debe implementarse de acuerdo con las especificaciones de diseño de construcción de fábrica limpia GB50073. El piso debe ser impermeable, anticorrosión, antifugas, antideslizante y fácil de limpiar. La pendiente de drenaje debe ser del 1%- 1,5%. La zanja de drenaje debe ser una zanja abierta de acero inoxidable en forma de arco, las esquinas deben ser redondeadas y las paredes y el techo deben ser a prueba de humedad, a prueba de moho, impermeables y fáciles de limpiar. 4.2.3 La sala de inoculación debe implementarse de acuerdo con las especificaciones de diseño del taller limpio GB50073. Se debe instalar una sala intermedia en la sala de inoculación de cepas líquidas, se deben instalar lavados de manos en la entrada y se deben instalar contenedores de basura cerrados en En el taller, se deben instalar tubos de escape o equipos de ventilación, y las puertas y ventanas deben estar equipadas con gasas protectoras contra mosquitos y moscas. 4.2.4 Los instrumentos y equipos principales deben estar equipados con equipo de tratamiento de agua, incubadora de cultivo líquido, compresor de aire, filtro de aire, inoculador de cultivo líquido, esterilizador de vapor de alta presión, caldera de vapor, banco de trabajo de purificación, incubadora de temperatura constante, agitador de temperatura constante, frigorífico, microscopio, agitador magnético, báscula, balanza, acidímetro, etc. En lugares con cortes de energía frecuentes, debe proporcionar su propia fuente de energía (generador). 4.2.5 El equipo de producción principal debe estar equipado con suministros de laboratorio biológico convencionales, como matraces Erlenmeyer de vidrio, máquinas de inoculación, tubos de ensayo, vasos y probetas medidoras, embudos de vidrio, placas de Petri, papel de filtro cuantitativo y cualitativo, papel para prueba de pH de precisión, etc. Las materias primas del sustrato de cultivo deben cumplir con los requisitos técnicos de seguridad de los sustratos de cultivo de hongos comestibles y alimentos libres de contaminación NY5099. Variedades de producción 4.4.1 Seleccionar variedades de hongo negro con alto rendimiento, alta calidad, fuerte resistencia al estrés y buenas propiedades comerciales, utilizar variedades registradas por el Comité de Aprobación de Variedades de Cultivos a nivel provincial o superior e introducir semillas de unidades de suministro de semillas con los correspondientes permisos técnicos. Calificaciones y buenas propiedades comerciales. 4.4.2 El proceso de producción de cepas debe cumplir con los requisitos del Reglamento Técnico de Producción de Engendros de Hongos Comestibles NY/T528. 5 Proceso de producción de cepas líquidas 5.1 Flujo del proceso 5.2.1 El recipiente utiliza tubos de ensayo de vidrio de 18 mm x 180 mm o 20 mm x 200 mm, y los tubos de ensayo deben mantenerse limpios y secos. 5.2.2 Fórmula del medio Medio de agar patata dextrosa (medio PDA para abreviar): 200 g de patatas, 20 g de glucosa, 20 g de agar, 1000 ml de agua, valor de pH natural. Medio integral de agar patata dextrosa (medio CPDA): 200 g de patata, 20 g de glucosa, 2 g de dihidrogenofosfato de potasio, 0,5 g de sulfato de magnesio, 20 g de agar, 1000 ml de agua, valor de pH natural. 5.2.3 Esterilización: Esterilización con vapor a alta presión a 121°C y 0,11MPa de presión durante 30 minutos. 5.2.4 La inoculación debe realizarse estrictamente de acuerdo con un funcionamiento aséptico en una mesa de trabajo ultralimpia. Una vez completada la inoculación, indicar en el tubo de ensayo el nombre de la cepa y el momento de la inoculación. 5.2.5 Cultivo De acuerdo con los requisitos de crecimiento de la cepa del hongo negro, proporcione una temperatura de cultivo de 24°C-25°C, mantenga una humedad relativa del aire de 65%-75% y evite la luz para el cultivo. 5.2.6 Las muestras de las cepas bacterianas retenidas deben conservarse para referencia futura, y el número de muestras retenidas debe ser de 3 cepas de la cepa madre por lote. Almacenar a 4°C-6°C hasta que surja la primera oleada de bacterias de este lote. Preparación de cepas líquidas en matraz agitador 5.3.1 El recipiente debe ser un matraz Erlenmeyer convencional de 1000 ml, que debe mantenerse limpio y seco. 5.3.2 La fórmula del medio es 3 % de glucosa, 2 % de harina de soja, 1 % de harina de maíz, levadura en polvo, 0,1 % de dihidrógeno fosfato de potasio, 0,2 % de carbonato de calcio, 0,05 % de sulfato de magnesio y un valor de pH natural. Almidón soluble 3%-6%, sacarosa 1%, dihidrógenofosfato de potasio 0,3%, sulfato de magnesio 0,15%, extracto de levadura 0,1%, valor de pH natural. 5.3.3 Preparación del medio de cultivo en matraz agitado. Pese las materias primas según la fórmula del medio de cultivo en matraz agitado. Primero pese el polvo de torta de frijol y la harina de maíz, mézclelos y envuélvalos con cuatro capas de gasa y átelos bien. Hervir agua hirviendo durante 20 minutos, sacarlas y filtrarlas con cuatro capas de gasa, llevar a volumen y añadir el resto de los ingredientes hasta disolver. 5.3.4 Volumen de llenado: Poner el medio de cultivo preparado en un matraz Erlenmeyer, el volumen de cada frasco es de 400ml y sellarlo con un tapón de silicona. 5.3.5 La esterilización es la misma que el método 5.2.3 de esterilización con vapor a alta presión. 5.3.6 Inoculación: Enfríe la botella de medio de cultivo esterilizado por debajo de 30°C y coloque la semilla en el matraz de agitación en la mesa de trabajo ultralimpia. Después de la desinfección rutinaria de la mesa de trabajo ultralimpia, inserte 0,5 cm2 de semilla madre inclinada 3 en cada botella en la superficie del líquido. Bloque ~ 5 piezas. El bloque de cepa contiene la menor cantidad de medio de cultivo posible, de modo que el lado micelial quede hacia arriba. El bloque de cepa debe flotar en la superficie del líquido. Una vez completada la inoculación, conecte el tapón de silicona. 5.3.7 Cultivo: Coloque el matraz Erlenmeyer inoculado en una incubadora a 25°C para cultivo estático durante 2 a 3 días. Cuando el bloque inoculado crezca hasta 1 cm en la superficie del líquido de cultivo, coloque el matraz Erlenmeyer en un horno rotatorio a 140 rpm. Agite el cultivo en una mesa vibratoria y cultívelo durante 7 días a una temperatura de cultivo de 25 °C, una humedad relativa del aire del 65 % al 75 % y protección de la luz, y luego prepare una cepa líquida en un matraz agitador. Preparación de cepas madre especiales para cepas líquidas 5.4.1 El recipiente debe ser un matraz Erlenmeyer convencional de 500 ml, el matraz Erlenmeyer debe mantenerse limpio y seco. 5.4.2 La fórmula especial de la semilla madre es 77% aserrín, 20% salvado, 2% azúcar moreno, 1% yeso, ingredientes: agua = 1:1,3, valor de pH natural. Nota: Utilice un tamiz de malla 20 para tamizar el aserrín y el salvado diversos, y utilice el aserrín y el salvado finos tamizados. 5.4.3 Preparación del medio de cultivo madre especial: Pese las materias primas de acuerdo con la fórmula del medio de cultivo madre especial, mezcle en seco cada componente de manera uniforme, luego agregue agua y revuelva repetidamente hasta que se mezcle uniformemente. 5.4.4 Volumen de llenado: Coloque el medio de cultivo madre especial preparado en un matraz triangular de 500 ml. La superficie del material debe aplanarse y compactarse. El volumen de llenado de cada botella es de 450 ml. Limpie la boca de la botella y séllela con un tapón de silicona. . 5.4.5 Esterilización Coloque el matraz Erlenmeyer lleno en una olla a presión para su esterilización. Comience a cronometrar cuando la temperatura alcance 121 °C y la presión sea 0,15 MPa y manténgalo durante 90 minutos. Espere hasta que la temperatura dentro del frasco baje de 30°C antes de usarlo. 5.4.6 Inocular en la mesa de trabajo ultralimpia, usar una pajita esterilizada para conectar la cepa líquida en el matraz de agitación al medio de cultivo madre especial esterilizado, con un volumen de inoculación de 10 ml/botella. Una vez completada la inoculación, indique el nombre de la variedad y el tiempo de inoculación en el tubo de ensayo. 5.4.7 El método de cultivo es el mismo que el método de cultivo del hongo negro 5.2.5. El micelio estará listo cuando esté lleno. 5.4.8 En este momento no se utiliza el almacenamiento de semillas madre especiales cubiertas con micelio. Se pueden almacenar en un refrigerador a 4 ℃ -6 ℃ durante tres meses para facilitar el acceso en cualquier momento. Inspección y limpieza del tanque de fermentación 5.5.1 Inspeccione todas las válvulas, válvulas de seguridad, manómetros, sellos y tuberías del tanque para asegurarse de que estén intactos y funcionando correctamente. 5.5.2 Limpieza: Enjuague el interior y el exterior del tanque y todas las válvulas con agua corriente para garantizar que no queden rincones muertos ni residuos de material de cultivo en la pared interior. 5.5.3 Se requiere que el tanque de cultivo esterilizado por aire se esterilice con aire cuando se usa por primera vez, se contamina con bacterias, se almacena por un largo tiempo o cuando se cambia la variedad. Para incubadoras con varillas eléctricas incorporadas, agregue agua hasta el 80 % del volumen, caliente a 121 °C y esterilice durante 40 minutos. Para las incubadoras esterilizadas con vapor externo, la presión del vapor alcanza 0,11 MPa~0,12 MPa, la temperatura es 121 ℃ ~ 124 ℃ y el tiempo de esterilización es 40 minutos. La fórmula del medio de cultivo líquido es 10% papa; 1,5% azúcar moreno; 1% glucosa; 4% salvado; 0,2% peptona; 0,2% dihidrogenofosfato de potasio; 0,1% sulfato de magnesio; VB1: 10 mg/L; 0,03% pepinillo. Preparación del medio de cultivo líquido: Pesar las materias primas según la fórmula del medio de cultivo líquido, primero pesar el salvado, hervir en agua hirviendo durante 20 minutos, filtrar el salvado con cuatro capas de gasa, luego agregar las patatas y cocinar. hasta que esté "crujiente pero no podrido", colar a través de una capa de gasa y agregar el resto de los ingredientes hasta que se disuelva. Ajuste de volumen y alimentación: abra la tapa de alimentación de la incubadora, agregue una cantidad adecuada de agua al medio preparado, revuelva uniformemente, viértalo en la incubadora, agregue agua para ajustar el volumen y la cantidad de alimentación del medio es el 70% del volumen total del tanque - 80%, luego apriete la tapa de carga. La incubadora en realidad abre la válvula de vapor para calentar la capa intermedia y la capa interna de la incubadora. Cuando la presión alcanza 0,05 MPa, abre la válvula de liberación de la incubadora para descargar aire frío. Cuando el vapor liberado se vuelve recto, cierra la válvula de liberación. Comience a cronometrar cuando la presión del vapor en la incubadora alcance 0,11 MPa-0,12 MPa y la temperatura del cultivo alcance los 123 ° C. Después de mantenerla durante 40 minutos, cierre la válvula de entrada de vapor y abra la válvula de escape de la incubadora para que la presión de la incubadora caiga lentamente ( la presión de la incubadora no puede bajar a cero), la esterilización de la incubadora se completa en este momento. Nota: La incubadora debe descargarse cuando comienza el tiempo, en la mitad y al final de la esterilización. Abra ligeramente la válvula de inoculación hasta que se descargue una pequeña cantidad de aire y material. El tiempo de descarga es de 3 a 5 minutos cada vez, y se descarga un total de 3 a 5 litros en tres veces. Enfriamiento y enfriamiento El enfriamiento del medio es el proceso de reducir el medio después de la esterilización de 123°C a 25°C. Encienda el interruptor de agua fría y use agua fría en circulación para enfriar. Después de la última descarga del material de cultivo para esterilización, abra ligeramente la válvula de entrada de aire de la incubadora, encienda el compresor de aire y proceda lentamente para permitir que el aire estéril que previamente pasó a través del filtro fluya hacia la incubadora. Controle la válvula de escape de la incubadora para controlar la presión de la incubadora a 0,04 MPa para presurizar la incubadora para mantener la presión negativa en la incubadora y enfriar el medio de cultivo por debajo de 30 ° C lo antes posible. Para la semilla especial, use un matraz triangular de 1000 ml para contener 750 ml de agua y esterilícelo en condiciones de alta presión de 121 ° C-126 ° C durante 40 minutos. Cuando la temperatura del agua baje de 30 ° C, coloque la semilla madre especial. Siembre en un banco de trabajo limpio sin Tritúrelo en condiciones bacterianas y viértalo en una botella de agua esterilizada para hacer una suspensión bacteriana. Para la inoculación, envuelva una gasa con un alambre con mango que tenga un diámetro interior ligeramente mayor que el puerto de inoculación, sumérjalo en alcohol al 95%, colóquelo sobre el puerto de inoculación y enciéndalo. Cierre la válvula de entrada del tanque de cultivo y abra la válvula de escape del tanque de cultivo. Cuando la presión del tanque de cultivo caiga por debajo de 0,01 MPa, abra el tapón de la botella de suspensión bacteriana, queme la boca de la botella en la llama durante 30-40 Segundos, abra la tapa del puerto de inoculación y retire las bacterias. Vierta la suspensión rápidamente en el frasco, cubra rápidamente el puerto de inoculación y apriételo. Retire el aro de fuego y apáguelo con un trapo húmedo. Abra la válvula de entrada de aire para introducir aire fresco en el tanque. Después de inocular el cultivo de cepa líquida, abra ligeramente la válvula de escape y elévela a 0,02 MPa-0,04 MPa, verifique la temperatura del cultivo y el flujo de aire. La temperatura del cultivo se establece en 25 ° C, el volumen de ventilación es de 6 l/min y la ventilación Presión 0,06 MPa. El tiempo de cultivo de la mayoría de las variedades de hongos negros es de 72 h a 96 h. 24 horas después de la inoculación se pueden tomar muestras del puerto de inoculación cada 12 horas para observar la germinación y crecimiento de la bacteria. Retención y prueba de muestras 5.14.1 Retención de muestras de cepas líquidas de matraces agitados; muestras de medio de cultivo en blanco después de la esterilización de la incubadora; las muestras extraídas de la incubadora regularmente durante el proceso de cultivo se utilizan para exámenes microscópicos y otras determinaciones de índices físicos y químicos. . Las muestras anteriores deben conservarse en un frigorífico a 4°C durante más de una semana. 5.14.2 Para las pruebas de esterilidad, las muestras retenidas antes mencionadas deben sembrarse en una placa de agar para pruebas de esterilidad y cultivarse a una temperatura constante de 28 °C durante 2 a 5 días. El crecimiento de las colonias debe observarse todos los días. No habrá colonias de bacterias, moho o levaduras creciendo en la línea debilitada, lo que indica que la muestra está libre de bacterias. Las muestras retenidas deben examinarse bajo el microscopio a tiempo después del muestreo para determinar el estado de crecimiento y desarrollo del micelio y si existe alguna contaminación por bacterias diversas. Indicadores para colocación de cepas líquidas en latas 5.15.1 Una vez verificada la calidad mediante examen microscópico y otros indicadores físicos y químicos, se puede inocular mediante luz. La temperatura del cultivo se ajustó a 24°C-26°C. 5.15.2 Los indicadores sensoriales se muestran en la Tabla 1. Indicadores del elemento: El color del líquido bacteriano es blanco, el micelio esférico es blanco y el filtrado es marrón. El líquido bacteriano es ligeramente viscoso, con una gran cantidad de escamas o micelio esférico suspendido, distribuido uniformemente y no estratificado rápidamente. , el líquido bacteriano no es turbio. El olor del líquido bacteriano tiene el aroma único del líquido de cultivo de hongos comestibles, sin ningún olor peculiar, ácido láctico, olor, etc. El olor del puerto de escape de la incubadora es normal y no presenta cambios evidentes. Tabla 1 Indicadores sensoriales 5.15.3 Los indicadores físicos y químicos se muestran en la Tabla 2 Tabla 2 Indicadores físicos y químicos Indicadores del artículo El valor de PH está dentro del rango normal de esta variedad Peso húmedo del micelio (g/100 ml) >8 Morfología del micelio e identificación de bacterias diversas bajo el microscopio se pueden ver hongos comestibles. Este tipo de medio de cultivo líquido tiene una forma de hifa única, con una gran cantidad de hifas esféricas y densas distribuidas, hifas gruesas, distribución uniforme del protoplasma dentro de las hifas y coloración profunda de los tintes; no hay moho. hifas, levaduras y células bacterianas. La prueba de esterilidad de las muestras retenidas mostró el crecimiento de hifas de hongos comestibles y no hubo crecimiento de moho, levadura o colonias de bacterias en los rasguños. Almacenamiento 5.16.1 Método para almacenar cepas líquidas en matraces batidos Las cepas líquidas en frascos batidos deben envolverse en papel kraft y almacenarse a 4 °C durante 5 a 7 días. 5.16.2 Método de almacenamiento de cepas líquidas en tanques de cultivo: El tanque de cultivo se puede almacenar a temperatura ambiente de 15 ℃ -20 ℃ durante 1 día a 2 días.
T/SYJ 0002-2023 Historia
2023T/SYJ 0002-2023 Technical regulations for the production of Xinjiang black fungus liquid strains