Principio: Después de desengrasar la muestra con n-hexano, se extrae con una solución de metanol/agua al 20%. El extracto se evapora hasta sequedad bajo presión reducida y luego se vuelve a disolver. La solución de muestra se utiliza en el monitoreo de reacciones múltiples (MRM) modo de cromatografía líquida de alta resolución/espectrómetro de masas Determinación, cuantificación por método estándar externo. 5 Reactivos y materiales 5.1 Reactivos A menos que se indique lo contrario, todos los reactivos son de grado analítico y el agua es agua de primer grado especificada en GB/T6682. Metanol (cromatográficamente puro). n-hexano (analíticamente puro). Ácido fórmico (cromatográficamente puro). Formaldehído (grado analítico). Glioxal (glioxal, GO, grado analítico). Ácido γ-aminobutírico (analíticamente puro). 5.2 Preparación del reactivo de solución de metanol/agua (20%): Pipetear 50 ml de metanol (5.1.1) en un matraz volumétrico de 250 ml y diluir a volumen con agua. Solución de ácido fórmico/agua (0,1%): Pipetear 0,25 ml de ácido fórmico (5.1.3) en un matraz aforado de 250 ml y llevar el volumen hasta la marca con agua. 5.3 Estándar de aducto de ácido γ-aminobutírico-glioxal-formaldehído (C11H16N2O4, número CAS: 805228-41-5): pureza superior al 98,0%. 5.4 Preparación de solución estándar Según necesidades, preparar una solución de aducto de ácido γ-aminobutírico-glioxal-formaldehído con una concentración de 10 mg/L con agua, y diluirla con agua para obtener una serie de soluciones estándar con concentraciones (100 μg /L, 500 µg/L, 1000 µg/L, 2000 µg/L, 3000 µg/L, 4000 µg/L). 6 Instrumentos y Equipos 6.1 Cromatógrafo líquido/espectrómetro de masas de triple cuadrupolo, equipado con fuente de iones por electropulverización (ESI). 6.2 Trituradora (finura: malla 30 a 100). 6.3 Balanza analítica, la sensibilidad es de 0,0001 gramos. 6.4 Balanza analítica, la sensibilidad es de 0,00001 gramos. 6.5 Centrífuga de alta velocidad (12000 rpm, 14000×g). 6.6 Vortexer (300 rpm ~ 3000 rpm). 6.7 Material de vidrio general de laboratorio. 7 Pasos de la prueba 7.1 Preparación de la muestra Pese 3 g de la muestra triturada (pasada a través de un tamiz de malla 60) en un tubo de centrífuga de 50 ml, agregue 10 ml de n-hexano para cubrir la muestra, agite durante 5 minutos y luego centrifugue a 10000 rpm durante 10 minutos, repita 3 veces para eliminar completamente la grasa, colóquela en una campana extractora para evaporar el n-hexano residual. Agregue 15 ml de solución de metanol/agua al 20 % al tubo de centrífuga, agite durante 5 minutos y luego centrifugue a 10.000 rpm durante 10 minutos para recoger el sobrenadante. Repita este proceso dos veces. Evaporar el sobrenadante hasta sequedad a presión reducida, añadir 20% de metanol/agua para disolver y ajustar el volumen a 5 ml. Filtre con un filtro de nailon de 0,22 μm y mida el contenido de ácido γ-aminobutírico-glioxal-formaldehído en la muestra utilizando el modo de monitoreo de reacción múltiple (MRM) de HPLC-MS/MS. 7.2 Determinación cromatográfica 7.2.1 Condiciones de referencia para cromatografía líquida de alta resolución a) Columna cromatográfica: columna acuosa de gel de sílice unido con octadecilsilano (C18), tamaño de partícula de relleno de 5,0 μm, longitud de columna de 250 mm, diámetro interior de 4,6 μm u otra columna cromatográfica equivalente; b ) Fase móvil: la fase A es una solución que contiene 0,1 % de ácido fórmico/agua, la fase B es metanol, grado de elución en gradiente: 0 a 2 minutos, 5 % B a 95 % B; 2 a 8 minutos, 95 % B a 95 % B ;8min~10min, 95%B~5%B; 10min~18min, 5%B. c) Caudal: 0,4 ml/min; d) Temperatura de la columna: 40 ℃. e) Volumen de inyección: 0,5μL. 7.2.2 Condiciones de referencia de espectrometría de masas a) Modo de ionización: ionización por electropulverización de iones positivos (ESI+); b) Modo de escaneo de iones: modo de monitoreo de reacciones múltiples (MRM); c) Voltaje capilar: 4000 V d) Voltaje de desagrupación: 50 V e) Gas de secado Temperatura: 300℃ f) Flujo de gas de secado: 10L/min g) Presión del gas de atomización: 50Psi h) Rango de iones de monitoreo: m/z50~800. i) Los iones cualitativos y cuantitativos se muestran en la Tabla 1: Tabla 1 Parámetros de voltaje optimizados del aducto de ácido γ-aminobutírico-glioxal-formaldehído Tipo de aducto voltaje de colisión del par iónico (eV) Ácido γ-aminobutírico-glioxal-formaldehído 241/155a 241/69 241/87 -16 -22 -22 a es el ion cuantitativo 7.2.3 Dibujo de la curva estándar Tome la solución estándar del aducto de ácido γ-aminobutírico-glioxal-formaldehído (100 μg/L, 500 μg/L, 1000 μg/L , 2000 μg/L, 3000 μg/L, 4000 μg/L), medido según las condiciones de referencia cromatográfica (7.2.1), con la concentración másica del aducto en la serie estándar como abscisa, y el área del pico es la ordenada y se dibuja una curva estándar. 7.2.4 Determinación de muestras: Inyectar 0,5 μL de cada una de la solución muestra y la solución estándar en el cromatógrafo líquido para su análisis, calificar el tiempo de retención del pico objetivo de la solución estándar y calcular el contenido de la sustancia a medir en la muestra en función del área del pico. El cromatograma de iones totales y el espectro de masas del aducto se muestran en el Apéndice A. 7.2.5 El experimento en blanco se llevará a cabo de acuerdo con las condiciones y procedimientos de medición anteriores, excepto que la muestra no se pese. 8 El contenido de aducto de ácido γ-aminobutírico-glioxal-formaldehído en la muestra de procesamiento de datos de prueba se calcula de acuerdo con la fórmula (1): …………………………………………(1) Medio de fórmula: х——El contenido de aducto de ácido γ-aminobutírico-glioxal-formaldehído en la muestra, microgramos/kg (μg/kg); C——La concentración del aducto en la muestra, μg/L (μg/ L); V ——el volumen total de la muestra a analizar, mililitros (mL); D——factor de dilución de la muestra; M——la masa de la muestra a pesar, gramos (g). Los resultados del cálculo se expresan como la media aritmética de tres resultados de medición independientes obtenidos en condiciones de repetibilidad, y los resultados conservan tres cifras significativas. 9 Precisión 9.1 Disposiciones generales La precisión de este documento se determina de acuerdo con las disposiciones de GB/T6379.2, y los valores de repetibilidad y reproducibilidad se calculan con un nivel de confianza del 95%. 9.2 Repetibilidad En condiciones de repetibilidad, la diferencia absoluta entre dos resultados de medición independientes obtenidos no deberá exceder el 10% de la media aritmética. 9.3 Reproducibilidad En condiciones de reproducibilidad, la diferencia absoluta entre dos resultados de medición independientes obtenidos no deberá exceder el 10% de la media aritmética. 10 Informe de prueba El informe de prueba debe proporcionar al menos los siguientes aspectos:
——Objeto de prueba;
——Estándares utilizados;
——Métodos utilizados;
——Resultados;
——Fenómenos anormales observados;
——Fecha de prueba. Apéndice A (Apéndice informativo) Cromatograma de iones totales y espectro de masas del aducto de ácido γ-aminobutírico-glioxal-formaldehído
T/GDBK 006-2023 Historia
2023T/GDBK 006-2023 Detection method of γ-aminobutyric acid-glyoxal-formaldehyde adduct in baked food——High performance liquid chromatography/mass spectrometry